Studio scientifico1

Sistemi antiossidanti nell’integrazione alimentare: risultati preliminari di uno studio scientifico

Dr. Alberto Fiorito, Medico chirurgo, La Spezia; Dr, Sauro Lorenzini, Università degli Studi di Siena Dipartimento di Medicina Clinica e Scienze Immunologiche, Sez. Reumatologia Direttore: Prof. Roberto Marcolongo

1. Introduzione

È dall’inizio degli anni ‘70 che si è compreso come il nostro organismo sia sottoposto all’azione dei radicali liberi, sia endogeni che esogeni. In condizioni fisiologiche alcuni di questi radicali liberi hanno funzioni utili per il nostro organismo. Quando, però, la generazione di sostanze radicaliche supera la capacità delle difese antiossidanti ne risulta uno stress ossidativo che si evidenzia in molte patologie umane e che talvolta dà un contributo significativo alla loro patogenesi. Il potenziale danno da eccesso di radicali liberi è controllato grazie ad una serie di meccanismi di difesa antiossidanti. Le reazioni radicaliche sembrano partecipare a numerose malattie ad etiologia e patogenesi diverse quali quelle infiammatorie-immunitarie, neoplastiche, dismetaboliche, degenerative di vari organi e strutture (1,2,3,4,5).

Nelle patologie reumatiche, in particolare, è riconosciuto il ruolo dei radicali e della lipoperossidazione nel determinismo della flogosi. Di qui l’interesse per lo studio di sostanze capaci di avere un effetto scavenger e antilipoperossidante (6,7,8,9).

Ci è sembrato interessante valutare un integratore come l’OxyLift, di cui abbiamo voluto valutare le capacità scavenger sui Reactive Oxygen Species (ROS).

L’OxyLift è un integratore composto da minerali biodisponibili per essere utilizzati direttamente dalla cellula, aminoacidi ed ha la possibilità di liberare H₂ ed O₂ a livello nascente, ovvero non proveniente dalla respirazione.

Abbiamo analizzato le capacità scavenger di OxyLift sulla produzione globale dei RLO (chemiluminescenza).

2. Materiali e metodi

Per i nostri lavori “in vitro” abbiamo utilizzato l’integratore OxyLift (International Biolife). Le esperienze condotte hanno preso in esame la valutazione dell’effetto scavenger dell’OxyLift a vari dosaggi con il metodo in chemiluminescenza.

La chemiluminescenza (10) è un metodo per valutare l’azione scavenger sul pool delle ROS prodotti da PMN stimolati con zymosan, (10 mg ^. ml^-1 di tampone fosfato senza Ca²⁺ e Mg²⁺; Sigma) opsonizzato secondo il metodo Bellavite (11). I polimorfonucleati (PMN) sono stati ottenuti da prelievi di sangue venoso periferico di soggetti sani mediante polymorphoprep (Nycomed), che, una volta centrifugato, forma un gradiente di densità sul quale si separano le cellule del sangue.

La purezza (> 90%) e la vitalità (> 95%) della popolazione cellulare sono state verificate mediante l’esame di uno striscio e l’esecuzione del test di esclusione del tripan blue.

In seguito, ad un’aliquota (100 ml) di una sospensione di PMN, 10^6.ml^-1 di PBS, sono stati aggiunti 100ml di luminolo (2mg in 10 ml di NaOH 0.01M diluito successivamente 1:10 con PBS; Sigma) e 10ml di stimolatore (zymosan). Il preparato è stato introdotto nel chemiluminometro (Berthold Multi-biolumat LB 9505C) a 37 °C; la cinetica della reazione è stata letta per 40 minuti (vedi schema 1).

I polimorfonucleati, fagocitano lo zymosan (fungo unicellulare), durante la fagocitosi, avviene quello che viene chiamato burst respiratorio, con liberazione di ROS. Questa reazione provoca una piccola emissione di energia che viene amplificata dal luminolo aggiunto e rivelata per 40’ dal luminometro in oggetto. La chemiluminescenza emessa e seguita nel tempo da origine ad una curva ed il software effettua l’integrale della curva stessa traducendo matematicamente la luminescenza letta. (vd grafico 1)

Schema 1

CAMPIONE 1 100 ml di sospensione cellulare + 100 ml di luminolo + 10 ml di zymosan (basale)

CAMPIONE 2 100 ml di sospensione cellulare + 10ml di PBS + 100 ml di luminolo + 10 ml di zymosan (basale 1)

CAMPIONE 3 100 ml di sospensione cellulare + 10ml di OxyLift* (Soluzione 1) + 100 ml di luminolo + 10 ml di zymosan

CAMPIONE 4 100 ml di sospensione cellulare +10ml di OxyLift* (Soluzione 2) + 100 ml di luminolo + 10 ml di zymosan

CAMPIONE 5 100 ml di sospensione cellulare + 10ml di OxyLift* (Soluzione 3) + 100 ml di luminolo + 10 ml di zymosan

CAMPIONE 6 100 ml di sospensione cellulare + 10ml OxyLift* (Soluzione 4) + 100 ml di luminolo + 10 ml di zymosan

Schema 2

OxyLift* Le soluzioni sono state preparate aggiungendo le gocce di prodotto a 50 ml di tampone PBS; una goccia corrisponde a circa 50 ml. Sono state preparate 4 soluzioni:

Soluzione 1 - 1goccia di OxyLift (~ 50µl) + 50 ml di tampone PBS

Soluzione 2 - 3 gocce di OxyLift (~ 150µl) + 50 ml di tampone PBS

Soluzione 3 - 5 gocce di OxyLift (~ 250µl) + 50 ml di tampone PBS

Soluzione 4 – 8 gocce di OxyLift (~ 400µl) + 50 ml di tampone PBS

Da queste soluzioni sono stati presi i 10ml indicati in metodica ed aggiunti alle cellule

3. Analisi statistica

L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando il test one way RM anova ed il test di Student Newman Keuls per confronti multipli. Una p<0.05 è stata considerata significativa.

RISULTATI

Nelle tabella (1) e nel grafico (1) sono riportati rispettivamente, nella prima, i valori medi di inibizione percentuale in riferimento ad un valore di inibizione 0 rilevato per la produzione basale dei ROS in assenza di soluzioni contenenti OxyLift, nel secondo sono riportate le medie dei colpi per minuto (c.p.m.) espressi nei 40’ di chemiluminescenza dai PMN stimolati con zymosan (anova, p=0.00394)

Da entrambe le rappresentazioni dei dati, si evince un’inibizione delle ROS dovuta alla presenza di OxyLift, e questa risulta essere dose-dipendente (Grafico n°1, Student Newman Keuls p<0.05).

GRAFICO 1

Il grafico mostra i colpi per minuto di luminescenza proporzionali alle ROS prodotte dai PMN stimolati con zymosan. I valori espressi sopra le colonne, rappresentano la media di 5 prove effettuate. (* p<0.05 Student Newman Keuls)

Colonna 1 BASALE

Colonna 2 BASALE 1 (Campione 2)

Colonna 3 Campione 3

Colonna 4 Campione 4

Colonna 5 Campione 5

Colonna 6 Campione 6

CHEMILUMINESCENZA, stimolazione con zymosan
OXYLIFT	% di inibizione
CAMPIONE 2	---
CAMPIONE 3	13.4 ± 7.14
CAMPIONE 4	16.7 ± 11.2
CAMPIONE 5	30.6 ± 2.3
CAMPIONE 6	37.5 ± 6.0

Tabella 1

La tabella esprime gli stessi dati del grafico ma sono espressi in percentuale di inibizione rispetto al basale dei c.p.m. prodotti in 40’ di chemiluminescenza dei campioni preparati (vd schema 1). I valori rappresentati sono il risultato di 5 prove effettuate in chemiluminescenza.

Dai risultati ottenuti si evince che l’integratore OxyLift è in grado di limitare le ROS prodotte da PMN umani stimolati, in maniera significativa e dose dipendente. Riportato sull’uomo è possibile ipotizzare che questo integratore alimentare possa contribuire all’effetto scavenger, cioè a potenziare i sistemi di difesa nei confronti dei radicali liberi. Di conseguenza si può supporre che l’integratore OxyLift possa avere un potenziale ruolo coadiuvante alla terapia per numerose patologie in cui la flogosi e la lipoperossidazione innescata dalle ROS hanno un importante ruolo patogenetico. L’originalità dei dati ottenuti, consiste nell’evidenza dell’azione scavenger dell’integratore OxyLift sulle ROS prodotte in vitro dai PMN umani del sangue periferico.

1) Fligiel SE, Ward PA, Johnson KJ, Till GO. Evidence for a role of hydroxyl radical in immune complex-induced vasculitis. Am J Pathol 1984; 155(3): 375-382.

2) Halliwell B, Gutteridge JMC, Blake D. Metal ions and oxygen radical reactions in human inflammatory diseases. Philos Trans R Soc. Lond [Biol] 1985; 311: 659-671.

3) Komara JS, Nyini NR, Biatick HA, Indrieri RJ, Evans AT, Garritano AM, et al. Brain iron delocalization and lipid peroxidation following cardiac arrest. Ann Emerg Med 1986; 15: 384-389.

4) Ratych RE, Bulkley GB. Free radical mediated postischemic reperfusion injury in the kidney. J Free Radic Biol Med 1986; 2(5-6): 311-319.

5) Burrel CJ, Blake DR. Reactive oxygen metabolites and the human myocardium. Br Heart J 1989 61: 4-8.

6) Menander-Huber KB. Orgotein in the treatment of rheumatoid arthritis. Eur J Rheumatol Inflamm 1981; 4(2): 201-211.

7) Jimenez RAH, Willkens RF. Dimethyl sulfoxide: a perspective of its use in rheumatic diseases. J Lab Clin Med 1982; 100(4): 489-500.

8) Greenwald RA. Therapeutic benefits of oxygen radical scavenger treatment remain unproven. J Free Radic Biol Med 1985; 1(3): 173-177.

9) Rice-Evans CA, Diplock AT. Current status of antioxidant therapy. J Free Radic Biol Med 1993; 15: 77-96.

10) De Luca MA, McElroy WD. Bioluminescence and chemiluminescence. Methods in Enzymol 1986; 133: 449-493.

11) English D, Roloff JS, Lukens JN. Regulation of human polymorphonuclear leucocyte superoxide release by cellular response to chemotattic peptides. J of Imm 1981; 126: 165-171.